Loading...

دستورالعمل الکتروفورز

هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح روند انجام کار و کنترل کیفی دستگاه الکتروفورز می باشد.

دستورالعمل الکتروفورز

1- هدف

هدف از تدوين اين دستورالعمل، تشريح روند انجام کار و کنترل کیفی دستگاه الکتروفورز می باشد.

2- دامنه کاربرد

اين دستورالعمل در بخش هماتولوژی كاربرد دارد.

3- مسؤليت اجرا

مسؤليت اجراي اين روش اجرايي با کارمندان فنی بخش های هماتولوژی و مسئول تضمین کیفیت مي باشد.

4- تعاريف

ندارد

5- شرح اقدامات

اصول:

جدا سازی پروتئین ها بر اساس اختلاف در شارژ الکتریکی انها در یک بستر بافری توسط این سیستم انجام می گیرد.

 

محلولها مواد و وسایل مورد نیاز در الکتروفورز همو گلوبین:

1-خون تام روی ضد انعقاد EDTAمثل CBC.

2-محلول Hemolysingجهت تهیه همولیزات.

3-محلول بافر Tris Glycine.

4- محلول رنگزا Amidoblack.

5- محلول رنگ بر.

6- محلول دهیدراتاسیون (متانول خالص ).

7- محلول شفاف سازی یا Cleaning.

8- ژل استات سلولز .

9- اپلیکاتور و شابلون .

 

اماده سازی محلول ها :

1- تهیه همولیزات :خون تام را 3 مرتبه با سرم فیزیولوژی شستشو می دهیم ودر مرحله اخر به کمک یک سمپلر λ1000تمت می سرم فیزیولوژی را خارج کرده به طوریکه Packed Cellحاصل شود.λ20از Packed Cell رابه λ100از محلول همولیزینگ در یک لوله اضافه کرده و خوب مخلوط می کنیم 3-2 دقیقه صبر می کنیم تا محلول شفاف حاصل شود.دقت شود که λ20از قسمت پایین لوله حاوی Packed Celبرداشته و پس از برداشت نوک سمپلر ازاضافی خون پاک شود.

2- تهیه محلول بافر Tris Glycine:یک بسته پودر بافر به 1500mlاب مقطر اضافه گردد.این محلول به مدت یک ماه در دمای یخچال پایدار می باشد.

3- محلول رنگ بر :100mlاب مقطر +100ml متانل خالص +10ml اسید استیک گلاسیال

توجه شود اسید استیک باید هر بار بطور تازه به مخلوط اب و متانل اضافه گردد.

سایر محلول ها به شکل اماده قابل استفاده می باشند.

 

اماده سازی ژل استات سلولز:

ابتدا پوشش ژل رابرداشته گوشه سمت راست بالایی ژل را قیچی می کنیم .این عمل جهت داشتن ترتیب بیماران الزامی است سپس ژل را به مدت 15 دقیقه داخل ظرف حاوی بافر تریس – گلیسین غوطه ور می سازیم به طوریکه سطح طلقی نگهدارنده ژل به سمت پایین قرار گیرد.

سپس ژل را از ظرف خارج کرده مابین دو کاغذ صافی قرار می دهیم و با فشار کم انگشتان رطوبت اضافی ان را به طور یکنواخت می گیریم.

ژل را روی شابلون قرار می دهیم بطوری که طلق نگهدارنده به سمت پایین قرار گیرد.

در این مرحله λ10 از محلول همولیزات را روی سکوی شابلون گذاشته و توسط اپلیکاتور نمونه برداری می کنیم .3-2 بار روی یک کاغذ صافی نمونه گذاری می کنیم .نمونه گذاری باید در فاصله 2 سانتی متری لبه بالای ژل انجام پذیرد.در حین نمونه گذاری باید نوک 5 ثانیه با کاغذ تماس پیدا کند.

 

اماده سازی تانک الکتروفورز:

تانک الکترو فورز ظرفی مستطیل شکل است که تیغه ای میانی دارد و به این ترتیب به دو قسمت تقسیم شده است در هر قسمت یک دیواره متحرک دارد.ابتدا در هر قسمت از بافر تریس – گلیسین می ریزیم روی دیواره های متحرک کاغذ صافی قرار می دهیم .این کاغذ باید در بافر خیس شودو سپس در روی دیواره ها قرار داده شود که این کاغذها در حکم پل انیونی هستند.

سپس ژل را روی دیواره های متحرک پوشیده از کاغذ صافی قرار می دهیم در این مرحله ژل بایستی بطور وارونه قرار گیرد یعنی طلق نگه دارنده به سمت بالا قرار گیرد .سپس قسمت بالا و پایین ژل دو عدد لام شیشه ای می گذاریم و درب تانک را می بندیم .سیستم های ان را به منبع تغذیه وصل می کنیم .ولتاژرا روی 250ولت تنظیم می کنیم و دستگاه را روشن می کنیم تا الکتروفورز به مدت 30 الی 40 دقیقه انجام پذیرد .در این ولتاژ جریانی بین 3-4 امپر بر قرار می شود پس از انجام عمل الکتروفورز دستگاه را خاموش می کنیم .درب تانک را باز می کنیم و ژل را خارج می سازیم .

 

رنگ امیزی :

ژل را به مدت 7 دقیقه داخل ظرف حاوی رنگ امیدو بلاک غوطه ور می سازیم و روی رو تاتور با دور پایین قرار می دهیم . در این مرحله نیز تا پایان مراحل طلق نگه دارنده در پایین قرار می گیرد.

 

رنگ بر :

اضافی رنگ را به کمک کاغذ صافی از لبه ژل می گیریم و ژل را داخل ظرف حاوی محلول رنگ بر می کنیم . در 3 مرحله رنگ بری انجام می دهیم . هر مرحله با محلول رنگ بر جدید انجام می شود و به مدت 5 دقیقه هر مرحله ادامه می یابد.

 

دهیدراتاسیون یا اب گیری:

ژل را داخل ظرف حاوی متانل فرو کرده به طوری که سطح ژل را کاملا بپوشاند این مرحله 1 دقیقه است.

 

شفاف سازی یا Clearing:

ژل را وارد ظرف حاوی محلول Clearingکرده و 5 دقیقه صبر می کنیم.

 

شفاف سازی در فور 70°c:

ژل را به شکل عمودی روی یک رک چوبی گذاشته و به مدت min 10داخل فور 70°cمی گذاریم تا کاملا شفاف شود.پس از این مرحله ژل چسبناک است که 20دقیقه در هوای ازاد و یا 10 دقیقه زیر نور چراغ مطالعه قرار می دهیم تا کاملا خشک شود.

 

قرائت باندها توسط دانسیتومتر :

به کتابچه راهنمای کاربر پیوست شده مراجعه شود.

 

کنترل و نگهداری :

جهت کنترل کیفی نمونه های انجام شده می توان Hb A2 و Hb F را به روش های ذیل اندازه گیری نمود و با نتایج حاصل از الکتروفورز مقایسه می کنیم.

1- Hb A2را با روش ستونی (کیتهای تجارتی ) چک شود.

2- Hb F هم با روش شیمیایی (کیتهای تجارتی ) چک شود.

 

سرویس و تعمیر:

به کتابچه راهنمای کاربر پیوست شده مراجعه شود.

 

ملا حظات ایمنی جهت کار با دستگاه :

به کتابچه راهنمای کاربر پیوست شده مراجعه شود.

 

تفاوتهای الکتروفورز هموگلوبین و سرم :

نمونه: در الکترو فورز سرم مراحل تهیه همولیزلت را نداریم و سرم بیمار بطور مستقیم مورد استفاده قرار می کیرد.

بافر: بافر مورد استفاده در الکتروفورز سرم Tris Ippurateاست.یک بطری از این محلول را به حجم ml1000می رسانیم .

رنگ: رنگ مورد پاسیو Sمی باشد.

رنگ بر :اسید استیک 5%است .

ولتاژ : ولتاژ 160 ولت است و شدت جریان 7-5 امپر خواهد بود.

بقیه مراحل درست مثل الکترو فورز هموگلوبین است.



ابزارها

جستجو در سایت

 

ورود به سایت

نام کاربری:
کلمه عبور: